Архітектор Вікентій Беретті, за проектом якого зводився університет, запропонував розташувати сад на пустирі, що прилягав до споруджуваного корпусу. Основою колекції саду мали стати рослини, які у 1833 р. було вирішено перевезти до Києва з Кременецького ліцею після його розформування, також використано рослини, вирощені з насіння, надісланого вітчизняними та європейськими ботанічними садами. За реєстром 1834 р. з Кремінця було прийнято 513 рослин 34 видів, які довелося розмістити в Царському саду (нині це місце є частиною Центрального парку культури й відпочинку).
І тільки 22 травня 1839 року перший ректор Київського університету ім. Святого Володимира Михайло Максимович разом із архітектором вікентієм Беретті й директором ботсаду Рудольфом Траутфеттером обрали для закладення саду горбкуватий пустир за майбутнім червоним корпусом, де протікала Либідь і паслася худоба. Тому датою заснування Київського ботанічного саду вважається 22 травня 1839 р.
Більш-менш завершеного вигляду університетський сад набув лише в 1852 році, коли територію обгородили парканом.
З 1914 р. до 1935 р. директором Ботанічного саду був Олександр Фомін. Він доклав титанічних зусиль для порятунку рослин під час лютої зими 1919–1920 років. 
У 1959 році прямо під станцією метро «Університет» у київському ботанічному саду було побудовано секретний урядовий об’єкт зв’язку К-2, що слугував для передачі та прийому секретних урядових телеграм і шифрограм, мав обмежений спектр пропуску. Його послугами активно користувалося КГБ, кожний із чисельних апаратів був налаштований з певним містом
14 липня 1995 р близько 19-ої години патріарх Володимир (Василь Романюк) отримав телефонний дзвінок. Після цього він одягнув світське вбрання і зі своєї резиденції пішов у Ботанічний сад Київського Університету. Там, серед квітучих жовтих азалій на лаві його очікували дві жінки. Згідно з офіційною версією, Романюку стало зле, стався четвертий інфаркт. Упродовж двох годин жінки намагалися його реанімувати, можливо, при масажі серця зламали йому ребра, а також робили йому прямі уколи в серце (що відзначено в акті судмедексперта), коли приїхала швидка, «реаніматори» зникли.
